多種細(xì)胞的培養(yǎng)方法

HePG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞的傳代：

 HePG2細(xì)胞屬人肝腫瘤的恒生細(xì)胞株，L-02細(xì)胞則是人胎肝細(xì)胞株，二者所使用的培養(yǎng)基可以是一樣的，即最常見的DMEM。一干使用低糖的。

　　細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶時(shí)既要傳代。使用胰酶消化即可。用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶。使用前37度預(yù)熱，細(xì)胞經(jīng)PBS清洗兩遍后，每個(gè)中號培養(yǎng)瓶加0.7ml的胰酶，胰酶的量可根據(jù)自己培養(yǎng)瓶的大小而定，原則就是能夠蓋滿瓶底。加入

胰酶以后，為使酶的活性最大，將培養(yǎng)瓶蓋擰緊后放回培養(yǎng)箱中，3分鐘左右即用含血清的培養(yǎng)基終止消化。如果在室溫情況下消化，時(shí)間相應(yīng)加長，可以在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞界限已十分清楚，即已分離為單個(gè)細(xì)胞，且有少量細(xì)胞漂起，則要終止消化了。

 16HBE細(xì)胞株的傳代方法：

　　鏡下觀察細(xì)胞生長融合達(dá)70-80%，準(zhǔn)備傳代。常規(guī)開紫外照射超凈臺(tái)20分鐘，同時(shí)把含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶、PBS放置37度培養(yǎng)箱中孵育。20分鐘后開始傳代。先棄掉舊培養(yǎng)液，加PBS洗一次，然后加0.25%胰酶2ml消化（指25乘25cm大小的培養(yǎng)瓶）細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞變圓，然后將培養(yǎng)瓶放置37度二氧化碳培養(yǎng)中孵育3分鐘左右（當(dāng)然時(shí)間是隨機(jī)的，比如：新配的胰酶作用時(shí)間短一些，配制時(shí)間長的胰酶作用時(shí)間會(huì)長一些，當(dāng)然要不斷地鏡下觀察），待細(xì)胞大部分消化下來（大部分細(xì)胞呈流沙狀脫離瓶壁），加4ml含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基終止消化。反復(fù)吹打瓶壁上殘留的細(xì)胞，并將已消化下來的細(xì)胞吹打均勻，然后吸入離心管中1000轉(zhuǎn)離心1分鐘，然后棄掉上清，用手指將離心管中的細(xì)胞彈打均勻，加新培養(yǎng)基，吹打均勻，分至3個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液。將培養(yǎng)瓶平放，小心移入37度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日觀察。

　　胃癌細(xì)胞AGS和SGC-7901的培養(yǎng)：

　　細(xì)胞傳代時(shí)不能長的太滿,70%-80%就可以傳了.實(shí)驗(yàn)前先把紫外燈打開照30分鐘,然后再把鼓風(fēng)機(jī)開10分鐘,同時(shí)把培養(yǎng)液和胰酶放入37度水浴箱中,千萬記住不要蓋上水浴箱的蓋子.傳代時(shí),我一般把培養(yǎng)瓶口過一下火,就直接把培養(yǎng)液到去,再用0.25%的胰酶(不含EDTA)消化.等細(xì)胞變圓,細(xì)胞間空隙加大就直接把培養(yǎng)液到去,不用離心,然后再吹打,雖說要輕柔,但很難吹打成單細(xì)胞懸液,所以稍用力也沒有關(guān)系.雖然操作不規(guī)范,但節(jié)省時(shí)間,細(xì)胞也沒有被污染.

 AAV-293細(xì)胞的傳代:

 AAV-293細(xì)胞較喜歡成團(tuán)生長,比較嬌嫩,怕冷,傳代時(shí)不要一次從二氧化碳培養(yǎng)箱拿出很多瓶,一次只要拿2-3瓶出來傳就可以了,否則細(xì)胞很容易死掉.細(xì)胞在50-60%傳代,細(xì)胞生長狀態(tài)最好.

　　用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶消化半分鐘左右,棄去胰酶.觀察培養(yǎng)瓶是否有針孔樣縫隙,如有就可以加入培養(yǎng)液吹打細(xì)胞.消化過久,對細(xì)胞損害很大,而且成團(tuán)很難吹打成單個(gè)細(xì)胞.然后加入含有10%小牛血清的DMEM.輕輕放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

　　肺癌細(xì)胞（人類），其中絕大部分都是貼壁細(xì)胞，具體如：

 （１）Ａ５４９（肺腺癌）

 （２）ＮＣＩＨ４４６（小肺細(xì)胞癌）

 （３）８０１（非小肺細(xì)胞癌）

 （４）ＮＣＩＨ４６０（大細(xì)胞肺癌）

 在消化傳代過程中，步驟基本一致：

　　吸去舊的培養(yǎng)液－＞用Ｈａｎｋｓ＇（１Ｘ）清洗一兩次－＞加入一定量的消化液（Ｔｒｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ）－＞置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞大部分變圓時(shí)，回到超靜臺(tái)－＞吸去消化液－＞加入一定量的新培養(yǎng)液－＞反復(fù)吹打細(xì)胞－＞再置顯微鏡下觀察，直到細(xì)胞全部懸浮起來－＞吸出一部分加入新的培養(yǎng)瓶中－＞最后再補(bǔ)充加入一定量新的培養(yǎng)液（ＲＰＭＩ１６４０ｗｉｔｈ １０％ ＦＢＳ）．

　　注意： 吹細(xì)胞時(shí)盡量多吹邊角兒，此處細(xì)胞生長的多．另外吸出細(xì)胞前要混勻．

　　另注：消化液的配制方法：

Trpsin-EDTA(1X)--0.25% Trpsin with EDTA-4Na prepared with 2.5g

Trpsin(1:250) and 0.38g EDTA-4Na/L in HBSS

　　小鼠前脂肪細(xì)胞（3T3-L1）：

　　吸棄原培養(yǎng)液-->PBS洗一兩次-->加入400ul0.125％胰酶（原代最好加0.05% EDTA）消化-->轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)盤，保證整個(gè)盤面都被trypsin液潤過->吸棄trypsin后37度消化3min-->以完全培液（DMEM+10% FCS＋1/1000Biotin+1/1000泛酸鈣-->吸打（槍的吸力調(diào)至最小），1：10接種，前后左右搖晃培養(yǎng)盤，細(xì)胞均勻后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)（10%CO2 ,37度）

MDBK（牛腎細(xì)胞）類型：貼壁細(xì)胞

　　來源：購自武漢病毒所細(xì)胞保存中心

　　由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心繁殖保存

　　傳代步驟：

　　棄去舊的生長液-->用無鈣鎂水(CMF)沖洗貼壁細(xì)胞數(shù)次(視細(xì)胞瓶的大小,3--5次)-->剩少許CMF,滴入 ATV 2--3滴-->搖勻細(xì)胞瓶中的液體,使ATV均勻的分布到瓶里的沒個(gè)地方-->放入37度二氧化碳溫箱中3--5min消化-->棄去ATV,加入生長液,拍打吸吹下細(xì)胞-->鏡下觀察-->分瓶-->作好記號,放入37度二氧化碳

　　溫箱生長

　　細(xì)胞特點(diǎn):該細(xì)胞生長力強(qiáng),而且快速一般24h就可以張到80%,48h不傳就會(huì)變的很老,所以該細(xì)胞傳時(shí)要勤點(diǎn);我感覺MDBK還是很好傳的,比以前我傳的ST、Vero細(xì)胞等要好傳一些，且不那么容易死亡，所以是我的一個(gè)比較好的選擇！該細(xì)胞適合接種皰疹病毒（如：偽狂犬病毒）！

 BHK-21：

　　棄除舊的培養(yǎng)液后---用緩沖液沖洗一遍----用0.22%的胰酶消化液消化約兩分鐘左右可以看到細(xì)胞像沙子一樣脫落-------趕緊倒掉胰酶加入含10%的牛血清培養(yǎng)液終止消化。但目前國內(nèi)能找到的BHK-21細(xì)胞大部分都有支原體感染，如果是好的BHK-21細(xì)胞能做到1比20的分種率。

　　補(bǔ)充一點(diǎn)關(guān)于BHK-21的培養(yǎng),先用少量胰酶沖洗一下,棄去,再用胰酶消化1min左右,效果會(huì)好一些

　　皮膚成纖維細(xì)胞和THP-1細(xì)胞：

　　皮膚成纖維細(xì)胞是貼壁生長的。THP-1細(xì)胞是懸浮的。

　　由于我們實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間也不是很長，所以也只能說說自己平時(shí)的操作了。 先說皮膚成纖維細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底，也就是細(xì)胞與細(xì)胞之間沒有間隙時(shí)，就可以傳代了。一般十天左右傳一代。先吸棄舊培養(yǎng)液，用D-Hanks液洗兩遍，再加入0.25%的胰酶，加入的量以能覆蓋瓶底為準(zhǔn)。加入后輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使液體覆蓋瓶底，然后靜置兩分鐘左右，最好是能在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞之間出現(xiàn)間隙且有一部分細(xì)胞呈現(xiàn)圓形后即可。吸去胰酶，加入含血清培養(yǎng)液，搖晃瓶子使培養(yǎng)液覆蓋瓶底就行了。因?yàn)檠蹇梢越K止胰酶的消化。然后吹打瓶底各處使細(xì)胞脫落。再分瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液。

 THP-1細(xì)胞的傳代就比較簡單了。

　　可以有兩種傳代方法。如果鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)很好，沒有其它雜質(zhì)即細(xì)胞裂解物之類的，就可以采用直接傳代法。傳代前將細(xì)胞培養(yǎng)瓶直立一個(gè)半小時(shí)使細(xì)胞自然下沉。吸棄上層少量培養(yǎng)液約三分之一，將余下的培養(yǎng)液分成兩瓶，再分別補(bǔ)加培養(yǎng)液即可。如果鏡下觀察覺得培養(yǎng)液中有雜質(zhì)即可采用離心傳代法。如果細(xì)胞數(shù)目較多可以低速離心約600轉(zhuǎn)離心六分鐘，細(xì)胞可以沉淀下來而且可以去除細(xì)胞碎片之類的雜質(zhì)。如果覺得細(xì)胞數(shù)目不多比較寶貴，那就提高轉(zhuǎn)速可以1000轉(zhuǎn)離心六分鐘，這樣細(xì)胞損失很少但可能也有些雜質(zhì)會(huì)一起沉淀下來。離心后去除上清液，加入新的培養(yǎng)液吹打渾勻即可分瓶傳代了。

　　目前的方法就這些，希望對新手有所幫助 BHK－21的經(jīng)驗(yàn)：

　　吸出培養(yǎng)基，吸得越干凈越好，直接加入1ml胰酶（T－25瓶），放到37度培養(yǎng)箱消化。是否需要用hanks 或 pbs之類得緩沖洗細(xì)胞并不絕對必要，我都沒有洗，感覺應(yīng)該洗一下更好，但也更麻煩并增加了污染得可能性。如果細(xì)胞長得太老，可以先加入1ml胰酶在細(xì)胞表面浸潤一下就吸出來，然后再加入1ml胰酶消化。胰酶在使用前最好預(yù)熱到37度。由于胰酶平時(shí)保存在4度，反復(fù)預(yù)熱對胰酶的活性不好，我的經(jīng)驗(yàn)是將胰酶進(jìn)行分裝，盡可能避免胰酶反復(fù)冷卻加熱。消化時(shí)間的選擇要根據(jù)實(shí)際情況決定，BHK－21還是比較好消化的，5－15min應(yīng)該足夠了，消化時(shí)間太長對細(xì)胞不利?？梢栽陲@微鏡下觀察消化情況，必要時(shí)可以拍打培養(yǎng)瓶幫助細(xì)胞分散，消化結(jié)束后直接加入培養(yǎng)基即可，胰酶會(huì)被血親滅活。一般在T－25瓶中留7－8ml培養(yǎng)基培養(yǎng)。在90％單層細(xì)胞時(shí)，1：4傳代2天后可長滿。如果使用的培養(yǎng)基偏堿最好先放在CO2培養(yǎng)箱中平衡。細(xì)胞生長中注意觀察培養(yǎng)基顏色（加入酚紅作指示劑），如出現(xiàn)偏黃表明細(xì)胞代謝產(chǎn)酸較多，此時(shí)如細(xì)胞未長滿應(yīng)更換部分或全部培養(yǎng)基以確保細(xì)胞狀態(tài)不受影響。

　　幾種乳腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)：

　　我養(yǎng)的細(xì)胞都是乳腺癌細(xì)胞，就是以下幾種，

 1、MCF-7：是一種很好養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞，培養(yǎng)基用DMEM或RPMI1640均可， 10－15％的小牛血清就能長得很好。一般兩到三天傳一代。傳代也很常規(guī)。吸出培養(yǎng)基，加入0.25％的胰酶1ml，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除殘余的培養(yǎng)基。再加入2ml胰酶（25ml培養(yǎng)瓶）靜置消化2－5min，待細(xì)胞縮起變圓，將胰酶吸出加入培養(yǎng)基3ml吹打成單細(xì)胞懸液分瓶即可。我一般都不用緩沖液沖洗，而直接用胰酶沖洗一下以去除剩余血清的作用，感覺效果還不錯(cuò)。因?yàn)镸CF-7消化較快，一般不放到培養(yǎng)箱中消化，以免消化太過。需要注意的是MCF-7生長較快如不及時(shí)傳代可出現(xiàn)整瓶細(xì)胞浮起，一般都來不及搶救。

 2、T47D：也是一種人乳腺癌細(xì)胞，培養(yǎng)基用DMEM＋10－15％的小牛血清，培養(yǎng)方法與MCF-7差不多，但這種細(xì)胞傳代時(shí)間長了會(huì)極難養(yǎng)。我曾養(yǎng)過一株新從美國購置的，兩三天傳一代，長得很旺。后又從國內(nèi)購買一株時(shí)間較長的，要七天傳一代，而且很嬌氣。

 3、MA891 鼠乳腺癌細(xì)胞：這種細(xì)胞比較特殊的是很難消化，容易消化成一團(tuán)一團(tuán)的，如果胰酶的量比常用的多三分之一充分預(yù)熱并放入培養(yǎng)箱中消化就會(huì)好的多。傳到15－20代細(xì)胞就易長成團(tuán)，從此生長緩慢，形態(tài)改變，需要復(fù)蘇重養(yǎng)。  

 95-D細(xì)胞的傳代:

　　首先要把0.25%的胰酶和培養(yǎng)液在37度水浴20~30分鐘(預(yù)熱). 從培養(yǎng)箱中拿出培養(yǎng)的細(xì)胞瓶(一般我是讓它長到90%幾再傳代的),吸去培養(yǎng)液,可用PBS洗兩遍.也可不洗.加入適量0.25%胰酶消化(試瓶子的大小而定,如250毫升的瓶子加1毫升就行了),讓它都浸濕細(xì)胞就可以吸去了.等個(gè)三十秒就在手上拍打,不要太用勁.就可以看到細(xì)胞脫落了,再加入3毫升左右的培養(yǎng)液吹打(這時(shí)加的培養(yǎng)液不要太多,否則難吹打成單個(gè)細(xì)胞!),制成細(xì)胞懸液,再傳至消毒的培養(yǎng)瓶中(我一般是1傳三,三天后又可以傳代了)再加入適量培養(yǎng)液(如250毫升瓶中加入12~14毫升).再放置在37度5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

　　在操作過程中要有酒精燈的,瓶口,鑷子等可在火上過一下.其他的地方可用75%的酒精消毒.無菌觀念要強(qiáng)!  

　　胃癌細(xì)胞MKN28和AGS：

 80%-90%confluency,吸棄原培養(yǎng)液-->PBS洗一次-->加入400ul0.125％胰酶（10cm）-->轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)盤，保證整個(gè)盤面都被trypsin液潤過->37度消化5-10min-->以完全培液（RPMI1640+10% FBS-->吸打,1：5接種，前后左右搖晃培養(yǎng)盤，細(xì)胞均勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)（5%CO2 ,37度，24h一個(gè)周期  

 L929細(xì)胞：

　　一種貼壁細(xì)胞，貼壁后繁殖迅速，約3－4天傳代。切記：不要等到細(xì)胞貼的太滿，約70－80％即可傳代（細(xì)胞傳代時(shí)不能長的太滿,70%-80%就可以傳了BSZLY2003）。否則細(xì)胞容易聚團(tuán)，再想將其打散很不容易，并且打散后細(xì)胞的狀態(tài)也不好了。我用的消化液是EDTA，新配的感覺特好用，胰酶也用過，但不如EDTA好用。以下傳代方法同樓上各位朋友。

　　另外還有一點(diǎn)建議：細(xì)胞傳代之前用75％酒精棉球擦一擦手。細(xì)胞培養(yǎng)瓶打開前也要擦一下，可以降低污染的幾率。  

 SP 2/0：

　　是小鼠骨髓瘤細(xì)胞株，貼壁生長，科室給學(xué)生開實(shí)驗(yàn)就用此細(xì)胞，所用培養(yǎng)基為1640，用小牛血清，濃度15%生長較好。培養(yǎng)孵箱為37度，5%的CO2。 開始將復(fù)蘇的細(xì)胞傳到小培養(yǎng)瓶（如25ml)，由于細(xì)胞分泌各種因子及細(xì)胞間的相互作用，因此生長較快，1-2天就可進(jìn)行傳代（當(dāng)然要達(dá)到80-90%的融合）。 消化采用0.25%的胰酶，在顯微鏡下觀察，看細(xì)胞形態(tài)變圓，而且細(xì)胞間界限明顯后，或有極少數(shù)細(xì)胞漂浮起來就可終止消化。

吹打時(shí)，動(dòng)作要輕、快，而且吹管中要吸滿液體，這樣就不會(huì)產(chǎn)生氣泡，吹打按一定的順序進(jìn)行，將瓶子徹底吹打，尤其是邊緣和角落。

傳代，先將此瓶細(xì)胞只傳到一個(gè)大瓶中，以保證細(xì)胞的數(shù)量，小瓶也可保留，繼續(xù)培養(yǎng)。這樣3-4天又可進(jìn)行傳代。  

 mcf-7細(xì)胞株：

　傳代要看細(xì)胞數(shù)的多少，一般來說10％的細(xì)胞，要5天左右，如果90％融合的細(xì)胞一傳2，3天子代細(xì)胞即可傳代。傳代：偶用的是25ml培養(yǎng)瓶，吸出培養(yǎng)基，6mlpbs沖洗3次，加入0.25％的胰酶2－3ml，胰酶均勻蓋滿瓶壁，消化2－5min左右（可以同時(shí)振搖），細(xì)胞縮起變圓，浮起，加入培養(yǎng)基2－3ml，不用太精確，吹打成單細(xì)胞懸液分瓶即可。室溫下消化即可，因?yàn)槭浅衫w維細(xì)胞，較為耐受胰酶，消化時(shí)間稍長亦可，要注意mcf-7細(xì)胞是一種腫瘤細(xì)胞，生長規(guī)律性差，很容易不均勻，要注意吹打的充分性  

 HSC-T6（大鼠肝星狀細(xì)胞系）：

　　棄培液-->以D-Hanks'液洗兩次-->0.05％胰酶消化-->鏡下觀察細(xì)胞變圓（約5分鐘）-->以完全培液（DMEM+10% FCS）終止反應(yīng)-->吹打，1:3 - 1:4接種，然后繼續(xù)培養(yǎng)。

　　該細(xì)胞系生長速度很快，所以采用1:3 - 1:4接種，而且換液間隔不要超過48h，否則細(xì)胞容易脫落下來。  

血液病細(xì)胞。

　　如Molt－4,Hl－60等：這些細(xì)胞的特點(diǎn)是懸浮生長，傳代方便，而且適應(yīng)能力強(qiáng)——————好養(yǎng)！

　　當(dāng)細(xì)胞生長到約2—8×10（6）后，即可認(rèn)為進(jìn)入對數(shù)生長期，此時(shí)傳代好，一般控制在2－5×10（6）之間最好，此時(shí)狀態(tài)最好。

　　傳代方法：（傳代前的消毒處理略）

　　直接在細(xì)胞懸液中加入一定比例的培養(yǎng)基。比例是根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排而定，此細(xì)胞一般24小時(shí)左右可以增長一倍數(shù)量，因此，如果現(xiàn)在的濃度為4，您明天要實(shí)驗(yàn)，則可1：1傳，————2×10（6）。明天同一時(shí)間大概就是4左右。 hl－60細(xì)胞：生長迅速，必須每天觀察，因此如果明天您要4×10（6），今天為4，就必須以1：2～3的傳。否則明天就已經(jīng)因濃度太大而不易實(shí)驗(yàn)。 因是懸浮細(xì)胞，所以觀察時(shí)以大小，圓不圓，顆粒多少，成團(tuán)情況，培養(yǎng)基顏色來觀察

 vero（非洲綠猴腎cell):貼壁細(xì)胞，以25ml小方瓶為例，培養(yǎng)液用的是MEM。 MEM的配制：10%小牛血清，1%雙抗，3%谷氨酰胺，1~1.5%NaHCO3. 傳代方法：

 1.倒掉培養(yǎng)液，如果細(xì)胞臟的話可用PBS洗兩次，否則不用。

 2.胰酶0.25%2ml消化1~3分鐘，容易消化. Molt－4：  

 3.倒掉胰酶，加MEM9~12ml,將貼壁細(xì)胞搖至懸浮，并用吸管吹勻，一傳三或一傳四。

 4.放置37度，5%CO2孵箱  

 Jurkat細(xì)胞（人外周血白血病T細(xì)胞）：是一種懸浮細(xì)胞：

 1、培養(yǎng)液：RPMI1640，15％小牛血清，2％Na2CO3，1％HEPES，青霉素100IU／1ml，慶大霉素100IU／ml；

 2、培養(yǎng)條件：5％CO2，37度，30％濕度；

 3、細(xì)胞復(fù)蘇：要快速將凍存管放入37度水中，不斷輕輕搖晃，直到細(xì)胞完全溶解，加入10ml左右的培養(yǎng)液，800～1000rpm，10分鐘離心，之后倒掉液體，加入新的培養(yǎng)基就可以進(jìn)行培養(yǎng)了；

 4、細(xì)胞培養(yǎng)：起初進(jìn)行傳代時(shí)由于細(xì)胞剛剛復(fù)蘇，長得比較慢，所以可以3～4天傳一代，傳過兩代后，一般2～3天傳一代，每次傳代后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，在傳過幾代合適的時(shí)候可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

 5、細(xì)胞凍存：1000rpm離心后，棄去液體，加入含有15％DMSO的凍存液，按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－80℃ 1小時(shí)）→液氮。

 6、我在做細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的一些小經(jīng)驗(yàn)：

 （1）細(xì)胞培養(yǎng)箱在每使用1個(gè)月最好用酒精擦洗一次，這樣可以減少污染；

 （2）雖然說加樣器放在紫外下照射會(huì)不準(zhǔn)，但我們還是丟了一把1ml的加樣器在超凈臺(tái)，沒有拿出來過，我想這樣也許會(huì)減少污染；

 （3）小牛血清我們用的是國產(chǎn)的，所以在一開始的時(shí)候加了15％的小牛血清，但細(xì)胞總是長不好，后來摸索條件，把小牛血清的量調(diào)到了20％，細(xì)胞生長旺盛；

 （4）HEPES雖然貴點(diǎn)，但加上去后細(xì)胞會(huì)長的不錯(cuò)；

 （5）在超凈臺(tái)操作前要用0.1％的新潔爾滅或75%酒精擦手  

 MCF-7細(xì)胞：

　　胞放在顯微鏡下觀察，細(xì)胞無污染、退縮，等其長滿培養(yǎng)瓶約70%-80%時(shí)即可進(jìn)行傳代操作，具體步驟如下：

1. 打開瓶蓋，棄上清,2.D-HANK‘S夜（以50ml培養(yǎng)瓶為例，下同）2吸管清洗后棄之；3.加0.25%胰酶2吸管；4.輕搖晃后置入37度溫箱；5.3-5分鐘后置顯微鏡下觀察，見細(xì)胞胞質(zhì)退縮，變圓；6.吸去胰酶，加含10%FCS的RPMI1640 3吸管；7.用洗管吹打，見細(xì)胞脫落，培養(yǎng)液變混，即可吸出加到新的培養(yǎng)瓶中。 注意事項(xiàng)：若胰酶消化超過時(shí)間，見細(xì)胞已漂浮，切不可直接倒去上清，可直接加等量的含10%FCS的RPMI1640，吹打后加到離心管中離心5分鐘，再棄上清，加入培養(yǎng)基進(jìn)行傳代  

 BALB/c-3T3：小鼠成纖維細(xì)胞。

　　消化過程：倒掉培養(yǎng)基——向培養(yǎng)瓶中加入少量37度預(yù)熱的0.25%胰酶，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶使胰酶浸過瓶底，倒掉胰酶——再向瓶中加入胰酶，加入量以能覆蓋細(xì)胞為宜，1分鐘后倒掉胰酶——將培養(yǎng)瓶置于37度孵箱中——顯微鏡下觀察，細(xì)胞開始變形時(shí)以含10%小牛血清的DMEM中止消化——吹打成單細(xì)胞懸液，1:2~1:3接種，繼續(xù)培養(yǎng)。  

 SKOV3細(xì)胞傳代方法：  

　　自CO2培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)瓶－>超凈工作臺(tái)中,以吸管輕輕吹打有細(xì)胞的瓶壁，去除生長不好的細(xì)胞-->棄去培養(yǎng)液-->加0.04%&<46; EDTA數(shù)滴 (用0.02%的EDTA不易消化掉) ，浸過細(xì)胞-->置37℃培養(yǎng)箱10min&<46;左右-->取出，倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞變圓回縮，但又未自瓶壁脫落--&<46;>超凈工作臺(tái)中棄去EDTA－>加入含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基--&<46;>吸管吹打后，1:2或1:3接種。&<46;  

 293細(xì)胞的傳代：

　　通常我是不用EDTA的只用0.25%的胰酶消化一般在細(xì)胞約80%匯合時(shí)傳代加入一毫升的胰酶后可以不用吸出胰酶（前提是用10%以上濃度的血清DMEM培養(yǎng)液）加上胰酶直接拍打至細(xì)胞脫落加入少許培養(yǎng)液中和后分瓶然后補(bǔ)加培養(yǎng)液 5%CO2孵箱 37度培養(yǎng)效果不錯(cuò)  

 HK2的傳代（人腎近曲小管上皮細(xì)胞)：

　　以50ml培養(yǎng)瓶為例

 1、細(xì)胞貼壁生長，長滿瓶底80％時(shí)，膠頭滴管移去培養(yǎng)液，可輕輕吹打，移液時(shí)不留培養(yǎng)液殘余

 2、加0.25％胰酶1ml消化37℃約2min，鏡下可見細(xì)胞基本圓形脫落，加含血清培養(yǎng)液2ml中止消化，反復(fù)混懸

 3、移入離心管，1200g，5min

 4、棄去上清，加入新培養(yǎng)液5ml，再次吹打混懸細(xì)胞，按需要分入新的培養(yǎng)瓶，鏡下可見散在分布圓形細(xì)胞

 5、入37℃5％CO2孵箱，半天即可再貼壁  

 caco-2（人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞）：

　　將Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)于高葡萄糖(的DMEM培養(yǎng)基中( 1%非必需氨基酸, L-谷氨酰胺（L-glutamine), 培養(yǎng)液含青霉素（ penicillin）10,000U/ml-鏈霉素（streptomycin）10,000ug/ml, 10%胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)）,長于T-75組織培養(yǎng)曲頸瓶中,通入5%CO2(相對濕度90%),置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)介質(zhì)2～3天更換一次,當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%融合后，以不含鈣,鎂離子的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后與胰酶(0.25%)—EDTA(1mM)于37℃一起孵育至分離(約5～10分鐘)。吹打細(xì)胞使之脫落，置離心管中1000rmp離心5分鐘。細(xì)胞重新懸浮于完全DMEM液中以1:3的比例分配至新培養(yǎng)瓶中。即完成傳代。  

 el7402和ECV-304：

 37度，5％CO2培養(yǎng)箱。  

　　消化前所用物品75％酒精擦拭后放到超凈臺(tái)上，紫外照射30min，同時(shí)胰酶和1640培養(yǎng)液（10％小牛血清，杭州四季青）75％酒精擦拭后放入37度培養(yǎng)箱平衡，進(jìn)無菌室開始傳代時(shí)取出。來蘇水托地，整個(gè)房間紫外消毒30min。開風(fēng)淋30min（時(shí)間寧長勿短啊，有一次弄得我的臉暴皮！半個(gè)月才緩過來）。Bel7402通常都是棄培養(yǎng)液（我通常是倒，覺得用吸管次數(shù)多會(huì)增加污染的機(jī)會(huì)，而我老師意見正好相反，郁悶啊），加入少量胰酶清洗，棄去后，加入胰酶2－3ml，培養(yǎng)箱內(nèi)放置3min左右，取出，加入培養(yǎng)液中和胰酶，輕輕吹打即可。  

 ECV－304培養(yǎng)條件同時(shí)。操作的時(shí)候步驟基本相同，只是加入胰酶消化的時(shí)間比Bel-7402稍微長1－2min  

　　卵巢癌的細(xì)胞：  

　　包括SKOV3、A2780、3AO、OVCAR3、HRA，幾種細(xì)胞的特性不完全一樣，但是我的傳代的步驟是基本一致的：細(xì)胞生長至80%匯合時(shí)傳代，先倒掉培養(yǎng)液，加預(yù)先加好雙抗的生理鹽水或PBS 5-10ml（100ml培養(yǎng)瓶）后輕輕搖晃數(shù)次后倒掉，

加0.25-0.35%的胰酶2ml，并使其分布均勻（這一點(diǎn)很重要，一定要注意工作臺(tái)是否平整，否則容易造成胰酶分布不均勻而細(xì)胞消化不同步），待細(xì)胞間隙變大時(shí)終止消化，加含10%血清的培養(yǎng)液（我用的是1640）4ml輕柔吹打，再按照需傳代的比例（1：2或1：3）補(bǔ)足培養(yǎng)液后分裝至2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中。若細(xì)胞碎片較多，可在消化后不倒掉胰酶直接加含血清的培養(yǎng)液吹打后500rpm離心5min，再用培養(yǎng)液重懸分瓶。消化所需的具體時(shí)間依細(xì)胞的種類和狀態(tài)而定，也和細(xì)胞的匯合程度有關(guān)，一般是80%匯合時(shí)最容易消化，若細(xì)胞長得太滿，消化時(shí)間要適當(dāng)延長，必要時(shí)可以將培養(yǎng)瓶移至培養(yǎng)箱內(nèi)消化。另外，一次性培養(yǎng)瓶要比玻璃培養(yǎng)瓶所需的消化時(shí)間稍長。

　　胰腺癌細(xì)胞我所養(yǎng)的是CAP，  

　　感覺不太好伺候，尤其是傳代時(shí)很困難。我一般是在倒掉培養(yǎng)液后，加生理鹽水或PBS沖洗，而后加一次胰酶作用3-5分鐘，倒掉胰酶，再加2-3ml新的胰酶繼續(xù)消化，這樣加兩次的效果好一些，但是吹打的時(shí)候還是很困難，總感覺細(xì)胞的貼壁能力太強(qiáng)了，明明看見細(xì)胞已經(jīng)變圓了，可就是吹不下來。現(xiàn)在想想可能在胰酶中加EDTA會(huì)好一些。

 CHO細(xì)胞：中國倉鼠卵巢細(xì)胞。  

 1、培養(yǎng)液用的GIBCO的RPMI-1640。里面加10%小牛血清，青霉素+鏈霉素。消化時(shí)用0.25%胰酶。  

 2、我都是1640配營養(yǎng)液時(shí)現(xiàn)加血清和雙抗，血清分裝后直接由-20度到37度水浴箱中溶掉，沒發(fā)現(xiàn)血清有沉淀現(xiàn)象。總體積100ml的培養(yǎng)液：90ml1640+10ml牛血清+1ml雙抗，無其他物質(zhì)了。培養(yǎng)過程中沒發(fā)現(xiàn)有什么問題。  

 3、傳代時(shí)，先吸掉培養(yǎng)液，我都不用倒掉的方法，怕由于瓶口而污染，都是慢慢吸管吸出的。然后培養(yǎng)液略微沖洗一下，加胰酶，倒置顯微鏡下見80%細(xì)胞變圓后，吸出胰酶，培養(yǎng)液終止消化。吹打下細(xì)胞，按所需稀釋比例傳代。我現(xiàn)在的CHO細(xì)胞狀態(tài)不是很好，但是瘋長，不知道為什么。所以每次傳代時(shí)，我都是留一滴足夠，差不多能稀釋20倍了。不知哪個(gè)戰(zhàn)友也養(yǎng)CHO細(xì)胞，多交流。  

　　小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的消化及傳代：

 RAW264.7因是單核巨噬細(xì)胞其生物學(xué)特性就是貼壁特別牢，普通的方法根本就不可能將它消化下來，這也是養(yǎng)這種細(xì)胞最頭痛的問題。現(xiàn)將我的一點(diǎn)心得，簡介如下：

　　消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，實(shí)驗(yàn)前加溫到37度

　　以50ml培養(yǎng)瓶為例：1、細(xì)胞貼壁生長，長滿瓶底80％時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加D-HANKS 漂洗兩次；2. 加入含胰酶和EDTA的消化液1－2ml,消化37℃約2-5min，鏡下可見細(xì)胞基本圓形回縮即中止消化，棄消化液加D-HANKS 漂洗兩次；3.加入新培養(yǎng)液10ml復(fù)吹打混懸細(xì)胞，按需要分入新的培養(yǎng)瓶；4. 入37℃5％CO2孵箱，幾小時(shí)后即可再貼壁。  

 SK-BR-3（乳腺腺癌細(xì)胞系）的傳代方法：

　　開始養(yǎng)SK-BR-3時(shí)，細(xì)胞狀態(tài)不是很好，貼壁也不均勻，于是開始想辦法，考慮是不是吹打的不夠，或是傳得過多，或是其它的什么，后來發(fā)現(xiàn)的確如此，細(xì)胞的生長狀態(tài)與傳代的方法有很密切的聯(lián)系。  

　　我的傳代方法是：

　　以50平方厘米培養(yǎng)瓶為例，待細(xì)胞長滿瓶底70％－80％

 1 吸除或倒掉瓶內(nèi)舊培養(yǎng)基。

 2 PBS 5ml加入培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，讓PBS流遍細(xì)胞表面，倒掉。

 3 PBS 5ml加入培養(yǎng)瓶重復(fù)洗一次，倒掉。

 4 加入1ml胰蛋白酶消化液，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面，然后置37度5％的二氧化碳培養(yǎng)箱放置5分鐘，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞脫壁、變圓即可。

 5 加入含血清的培養(yǎng)基5ml中止消化，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，確保所有的瓶底都要吹打到。

 6 吸1/3至1/4的細(xì)胞懸液接種至新的培養(yǎng)瓶，然后加8ml的新的細(xì)胞培養(yǎng)基，置37度5％的二氧化碳培養(yǎng)箱完成傳代。  

　　飼養(yǎng)層細(xì)胞STO的傳代：

 1.當(dāng)細(xì)胞鋪滿整個(gè)平皿(100mm)后,吸棄舊培養(yǎng)液，10mLPBS洗一遍

 2.0.25%胰酶（預(yù)熱20分鐘左右）2ml消化，輕輕搖晃，直至肉眼見單層細(xì)胞呈塊狀脫落（或在顯微鏡下觀察細(xì)胞之間分離），立刻加5ml(DMEM+10%FBS)終止消化，輕柔吹打8-10次成單細(xì)胞。

 3.離心1000rpm*5min,棄上清，加DMEM+10%FBS輕柔吹打。

 4.將細(xì)胞懸液1:4傳到100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每個(gè)皿加10ml(DMEM+10%FBS)培養(yǎng)液，正常情況下2-3天就可以長滿，期間不用換液。

　　小鼠ES-R1細(xì)胞系傳代：

　　因?yàn)槲覀冇蔑曫B(yǎng)層細(xì)胞鋪皿而不是明膠包被，所以傳代之前必須處理飼養(yǎng)層細(xì)胞。

 1.飼養(yǎng)層細(xì)胞STO處理：當(dāng)STO鋪滿平皿后，向培養(yǎng)液中加入100ul1mg/mlmitomycinC(toxic, 操作時(shí)不要接觸，作用是抑制STO增殖)，輕輕搖晃平皿，保證絲裂霉素分布均勻，放置于培養(yǎng)箱中處理2h后，吸棄培養(yǎng)液，10mlPBS洗兩遍（目的是把mitomycinC洗凈），0.25%胰酶消化，5ml(DMEM+10%FBS)終止，離心1000rpm*5min棄上清，加DMEM+10%FBS后吹打均勻，種到新的100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，補(bǔ)齊培養(yǎng)液至10ml。置于培養(yǎng)箱中過夜。

  2.第二天早上傳干細(xì)胞：

 （1）吸棄舊培養(yǎng)液，10mlPBS洗一遍，2ml 0.25%胰酶消化，邊消化邊輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，4-5min后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)部分細(xì)胞脫落，成小的細(xì)胞團(tuán)塊，加8ml DMEM+10%FBS終止消化，輕柔吹打。

 （2）然后將液體轉(zhuǎn)移到15ml塑料離心管中，靜置10-15min，吸棄上清，加2mlES培養(yǎng)液。

 （3）將滴管在酒精燈下拉成非常細(xì)的玻璃管，吹打1－2次，盡量將ES吹散

 （4）將前一天鋪好的STO的培養(yǎng)液吸棄，換成10ml的ES培養(yǎng)液（操作要小心，不然STO很容易脫落），再把塑料離心管中的ES1:3或1:4(視情況而定)傳到鋪好的STO皿中，前后左右垂直晃動(dòng)幾下，使干細(xì)胞分布均勻，置于培養(yǎng)箱中，每天換液，兩到三天傳代。

　　應(yīng)該注意的問題：

 1.STO不管是在ES傳代還是換液過程中都可能因?yàn)榧右后w速度過快而脫落，所以最好靠近培養(yǎng)皿壁先一滴一滴加，避免液體直接打在STO上。 2.玻璃管拉得盡量細(xì)一些。 3.一定要把mitomycin洗干凈

 HepG2細(xì)胞株的傳代經(jīng)驗(yàn)：

　　首先在倒置顯微鏡下觀察生長融合達(dá)80%，不需要長滿，就準(zhǔn)備傳代。倒掉舊的培養(yǎng)基，再用已經(jīng)高壓滅菌過的PBS洗1－2次，我用的是25平方厘米的培養(yǎng)瓶，加入1毫升已經(jīng)配制好的0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA(0.25%胰蛋白酶是用D-Hanks配制后先用濾紙過濾，再用一次性過濾器過濾除菌，再分裝成1ml的小包裝，剛好每次用完一個(gè)，避免每次反復(fù)凍存，會(huì)使胰酶的活性下降），加入的量以剛好蓋滿瓶底為宜。放到倒置顯微鏡下觀察變化，一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始變園收縮，大約1－3分鐘時(shí)間，必要時(shí)可以吹打幫助細(xì)胞分散，就立即加入培養(yǎng)基中和胰酶，如有EDTA最好要離心（800rpm,5min)，棄上清夜，再加入完全培養(yǎng)基吹勻，再分瓶，一般一瓶可以分2－3瓶。放入5%的CO2培養(yǎng)箱，37度培養(yǎng)24小時(shí)后觀察。  

 hela細(xì)胞的培養(yǎng)條件為:

　　高糖DMEM培養(yǎng)基,100ml/l胎牛血清;培養(yǎng)液中一般血清含量為10%

　　傳代步驟:

 1．倒去細(xì)胞培養(yǎng)液(對于小口的培養(yǎng)瓶可采用頃倒方法,對于培養(yǎng)皿,必須用吸管吸出)  

 2．吸取適量的PBS加入培養(yǎng)瓶中,輕輕振蕩后棄去重復(fù)一次,以清于血清成分, 利于胰酶消化

 3．加入適量0.25%胰蛋白酶（一般100mm培養(yǎng)皿可加入1ml，15cm培養(yǎng)瓶加入5-8滴）轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使其濕潤整個(gè)細(xì)胞房，高溫下消化2-3分鐘。

　　翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，肉眼觀察細(xì)胞單層，見細(xì)胞單層薄膜出現(xiàn)針孔大小空隙時(shí)即可頃去消化液，如消化程度不夠可延長消化時(shí)間，或置于37°C孵箱中加速胰酶作用如見大量細(xì)胞片裝脫落，已消化過頭，則不能頃倒消化液而直接進(jìn)行下一步操作

 4．加入適量培養(yǎng)液終止消化

　　吸取瓶中培養(yǎng)液反復(fù)沖瓶壁上的細(xì)胞層，至全部沖下輕輕吹打，混勻，成細(xì)胞懸液取樣計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5′10 /ml  

 15cm培養(yǎng)瓶培養(yǎng)時(shí)，吸取1ml細(xì)胞懸液加到新培養(yǎng)瓶中，加入4ml培養(yǎng)液，蓋好,置37°C孵箱中培養(yǎng)。

　　傳代的天數(shù)要以HELA細(xì)胞的生長密度為基礎(chǔ),細(xì)胞密度大了就要傳,應(yīng)該每天觀察HELA細(xì)胞,注意其生長狀態(tài).HELA細(xì)胞的生長分5期:

　　游離期

　　細(xì)胞經(jīng)消化分散后，由于愿生質(zhì)收縮及細(xì)胞彈性，細(xì)胞成圓形，折光性強(qiáng)，呈懸浮狀態(tài)。

　　吸附期

　　接種24小時(shí)后，由于細(xì)胞的附壁特性，開始貼壁，圓形細(xì)胞變成延展?fàn)顟B(tài)。

　　繁殖期

　　細(xì)胞快速生長、分裂，形成細(xì)胞島直至細(xì)胞單層。

　　維持期

　　細(xì)胞形成單層后生長與分裂減緩、折光性減弱，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，由于代謝物的積累，CO2增多，培養(yǎng)液變黃。

　　衰退期

　　如不及時(shí)換液和傳代，由于營養(yǎng)缺乏、代謝物積累，細(xì)胞內(nèi)顆粒進(jìn)一步增多,立體感差，細(xì)胞皺縮、脫落、逐漸衰老死亡。

　　應(yīng)該在其維持期和衰退期及時(shí)換液.一般而言是4天換一次液. 祝你實(shí)驗(yàn)順利!  

 S180腫瘤細(xì)胞的,

 S180腹水型腫瘤細(xì)胞平時(shí)可以在小鼠腹腔中轉(zhuǎn)種傳代.我們科室保種時(shí)就這樣的.

　　在有的試驗(yàn)時(shí)需在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)一段時(shí)間,由于其增殖較快,培養(yǎng)時(shí)密度不宜大,一般10*5/ml就夠了;通常2天就需換一次液,由于其是懸浮細(xì)胞，無須消化,直接離心去上清,PBS洗滌,用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液就可以了.其要求條件相對較底,一般培養(yǎng)室都能達(dá)到.

　　我平時(shí)還養(yǎng)小鼠的淋巴細(xì)胞,我們養(yǎng)的是混合淋巴細(xì)胞,不是單一的細(xì)胞株(或系),主要特點(diǎn)是如果需要傳代培養(yǎng)要加IL-2(出于經(jīng)費(fèi)考慮,我們就用人源IL-2,因?yàn)镮L-2具有沿種系普向上約束性,而鄉(xiāng)下無約束性)50~100u/ ml,換液時(shí)可以離心去上清,可以用PBS洗滌兩一次,加入含10%小牛血清就可以了,其他注意事項(xiàng)同一般的培養(yǎng).  

　　小鼠成肌細(xì)胞C2C12和人橫紋肌肉瘤A204細(xì)胞的消化傳代方法 供大家參考:

 1)細(xì)胞消化液的配制及存儲(chǔ):我采用的是0.25%Trypsin+0.05%EDTA的消化液,BUFFER采用的是D-Hank's液.配完后分裝成4-5ml/tube,于-20度冰箱中儲(chǔ)存.

 2)消化前的處理:當(dāng)細(xì)胞生長至亞融和狀態(tài)需要傳代時(shí),提前半小時(shí)將配好的消化液放在細(xì)胞培養(yǎng)孵箱中預(yù)熱,同時(shí)將配好的高壓無菌的D-Hank's液也進(jìn)行預(yù)熱.

 3)消化細(xì)胞:將預(yù)熱的D-Hank's液洗細(xì)胞2次,2ml/25cm2,然后再加入預(yù)熱的消化液,作用3-5min,并反復(fù)振蕩,鏡下觀察.當(dāng)細(xì)胞被消化成單個(gè)圓球狀時(shí),加入等體積的培養(yǎng)基中止消化,然后反復(fù)吹打,將消化后的細(xì)胞懸液,全部吸出后置于離心管中離心,1000rpm,10min.

 4)傳代接種細(xì)胞:離心完畢后,棄去上面的上清,加入新鮮預(yù)熱的培養(yǎng)基,并計(jì)數(shù),按要求接種的密度接種到新的培養(yǎng)瓶中即可.

　　這種方法的優(yōu)點(diǎn)是:細(xì)胞消化徹底,損傷小,接種均勻,易于控制密度等.

 hepa1-6和p19細(xì)胞。

 hepa1-6是小鼠肝癌細(xì)胞，p19細(xì)胞是小鼠畸形胎瘤細(xì)胞，前者須用10%胎牛血清的DMEN養(yǎng)，后者須用10%胎牛血清的FD養(yǎng)，且經(jīng)常在傳代初期出現(xiàn)生長狀態(tài)不好，要反復(fù)洗滌后換液，多觀察。  

 Ecv304細(xì)胞的培養(yǎng)

 Ecv304細(xì)胞也很好培養(yǎng)．用含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)，一般２－３天長到８０％即可傳代，傳代是吸去培基，，用ＰＢＳ沖洗，加入0.０5%的胰酶＋0.02%的EDTA，３７度消化１分鐘，加含有10%小牛血清的DMEM終止消化，吸管輕輕打散細(xì)胞，然后加培基放入37度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即可．

　　小鼠肝癌H22體內(nèi)傳代的詳細(xì)步驟：

 1.腹腔種植小鼠肝癌H22細(xì)胞后第5-7天時(shí)，將小鼠頸椎脫臼處死，于75%酒精浸泡1-2分鐘或腹部消毒。

 2.于無菌條件下用5 號針頭注射器抽取腹水，并置于10～50 ml離心管內(nèi)，用生理鹽水(NS) 10倍稀釋，吸管充分吹打均勻，1 000 r/min-1離心5#ml 7 min，傾出上清，按一定比例加入生理鹽水，配制成瘤細(xì)胞懸液5-10*10^7/ml，0.2 ml/只，接種到小鼠腹腔。

 3.為簡單起見，也可將抽取的腹水用生理鹽水做簡單稀釋（1：2～1：4），0.2 ml/只，腹腔傳代。

 4.下次傳代時(shí)，重復(fù)以上步驟即可。小鼠肉瘤S180腹腔體內(nèi)傳代同上。  

 H22小鼠肝癌細(xì)胞株

　　是腹水型細(xì)胞株，懸浮生長。液氮冷凍保存。使用時(shí)取出復(fù)蘇，用1640加10%新生牛血清培養(yǎng)，三天后取液計(jì)數(shù)成1＊108濃度，取0.08ml注入小鼠腹腔，7天左右腹水可用，一般要低速離心去掉巨噬細(xì)胞等混雜細(xì)胞，腹水得到的細(xì)胞比培養(yǎng)瓶中生長的細(xì)胞活力高，皮下接種成瘤率為100％。本法傳代可靠性高，細(xì)胞活力強(qiáng)，致瘤率高。  

　　神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞傳代經(jīng)驗(yàn)：

 1、倒掉培養(yǎng)液,用D-HANKS洗兩次

 2、加入0.125％胰酶/0.02％EDTA（1：1），蓋滿瓶底為宜。

 3、將培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間隙增大，突起回縮后豎起培養(yǎng)瓶，倒掉消化液。

 4、用D-HANKS洗一次，此時(shí)動(dòng)作要輕

 5、加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，接種至培養(yǎng)瓶中。

　　注意：

 1、0.125％胰酶/0.02％EDTA的PH值和溫度重要，即PH值（7.5），溫度 （37℃）

 2、如果消化速度過快，細(xì)胞掉下來，也不要緊，加D-HANKS或完全培養(yǎng)液終止消化，離心1000r/min，10分鐘即可

 3、輕輕吹打  

　　大鼠肝癌細(xì)胞系CBRH7919

　　我國自己培養(yǎng)的細(xì)胞系，最初是用二乙基亞硝胺誘發(fā)的Wistar大鼠肝癌組織傳代而成。此細(xì)胞系增殖力很強(qiáng)。

　　傳代方法：細(xì)胞長到90%以上，棄培養(yǎng)液->0.25%胰酶消化->消化時(shí)間1.5-2min->吸棄胰酶->加入1640培養(yǎng)液，10%胎（小）牛血清->傳代（一般一傳三） 如胰酶消化時(shí)間增加，可通過離心沉淀細(xì)胞后加入培養(yǎng)液傳代，但這樣增加傳代時(shí)間，而且該細(xì)胞系粘附性較強(qiáng)，離心后易形成細(xì)胞團(tuán)，且不易分散。  

 293細(xì)胞

 293貼壁很不牢，可以不加消化液直接吹打下來，但這樣下來的細(xì)胞容易聚成團(tuán)，傳代后形態(tài)不大好看?？梢韵鹊沟襞囵B(yǎng)液，以D-HANK‘S液輕輕沖洗，再加0.6ml 0.25%胰酶/0.01%EDTA，輕輕潤濕細(xì)胞后即可棄去，置于鏡下觀察，很快即可見細(xì)胞變圓，加入適量完全培養(yǎng)基終止，輕輕吹打即可。這樣細(xì)胞既不會(huì)消化過頭，又極盡吹散。

　　膀胱癌 T24細(xì)胞（貼壁的）。

　　心得如下：

 1、 T24長的非常快，傳代一般1：5傳，每4天需要再傳。

 2、雖然是永生化細(xì)胞，也一定不要等細(xì)胞100%匯合再傳代，多次這樣細(xì)胞狀態(tài)不好，球形增加，還不容易洗掉。

 3、要用胰酶（0.25%）--EDTA（0.01%）混合消化液消化好些，一般1分鐘內(nèi)呈球形，即可混懸細(xì)胞了。

 4、培養(yǎng)液用10%小牛血清的DMEM或1640都可以。

　　步驟：吸凈培養(yǎng)液， PBS洗2次，加消化液室溫一分鐘左右，要在顯微鏡下注意觀察，不要過頭，球形后，吸掉消化液，加1毫升培養(yǎng)液，吹打混勻，1：5傳代。  

 SMMC－7721，肝癌細(xì)胞株：

 1、 SMMC－7721開始長的比較慢，呈花瓣?duì)?，成片后迅速增殖，?xì)胞由于過密開始變小，如果不及時(shí)傳代，會(huì)清楚的看到細(xì)胞張成兩層，下層細(xì)胞大一些，上次呈圓形，小。

 2、3-4天可以傳代，傳代時(shí)稀釋度視情況而定，一般1：3 - 5

 3、用胰酶（0.25%）--EDTA（0.01%）混合消化液消化，消化時(shí)間較長，大約5分鐘，當(dāng)細(xì)胞過多時(shí)時(shí)間更長，建議分兩次消化，既先消化下來的一部分倒出加培養(yǎng)液（培養(yǎng)液用10%小牛血清的1640)終止，剩下的細(xì)胞繼續(xù)加消化液消化。 步驟：倒凈培養(yǎng)液，胰酶洗1次，倒盡，加胰酶消化液置于37度，在顯微鏡下注意觀察，細(xì)胞變圓后，倒掉消化液，培養(yǎng)液，吹打混勻，1：3-5傳代。

 293T,貼壁細(xì)胞：在消化傳代過程中，步驟如下：

　　用滴管吸盡舊的培養(yǎng)液－＞用培養(yǎng)基洗一次－＞加入一定量的胰酶（已預(yù)熱）-＞顯微鏡下觀察，待細(xì)胞大部分變圓時(shí)，回到超靜臺(tái)－＞用滴管吸盡酶液－＞加入一定量的含血清的新培養(yǎng)液－＞反復(fù)吹打細(xì)胞－＞再置顯微鏡下觀察，直到細(xì)胞全部懸浮起來－＞吸出一部分加入新的培養(yǎng)瓶中－＞最后再補(bǔ)充加入一定量新的培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱。

　　可用含有血清的DMEM，也可以用含有血清的1640。  

 HELF(人胚肺成纖維細(xì)胞),

　　這也是一種貼壁生長的細(xì)胞,所以傳代培養(yǎng)時(shí)的大概方法沒有什么不同.但這種細(xì)胞貼壁貼得不是很緊,所以消化過程中有幾點(diǎn)注意事項(xiàng)(本人總結(jié)):

 1.當(dāng)?shù)钩鲈信囵B(yǎng)液時(shí),最好將培養(yǎng)瓶反過來,即有細(xì)胞的面朝上.

 2.如用EDTA消化,最好先讓其消化3分鐘,后每一兩分鐘看一次.

 3.每次看時(shí)不要太過晃動(dòng)瓶子,以防細(xì)胞成片脫落.如果細(xì)胞成片脫落了就比較麻煩了,因?yàn)榧?xì)胞已經(jīng)脫落,就不得不終止消化,但實(shí)際上細(xì)胞與細(xì)胞間的連接并沒有完全斷開,吹打也分不開,那樣分出來的細(xì)胞也就成團(tuán),則不利于細(xì)胞貼壁及生長.

 4.如果在終止消化前有細(xì)胞脫落,不要浪費(fèi),先加Hank's液終止消化,然后離心,收集細(xì)胞,再讓其生長.

 5.細(xì)胞生長狀態(tài)好時(shí),一般5-7天可以長滿,其間換一次液就可以了.

 6.但我也遇到過生長不太好的情況,細(xì)胞長了12天才長滿,且其中有幾天幾乎沒長或出現(xiàn)大量黑色死細(xì)胞團(tuán),這時(shí)不要放棄,只要活細(xì)胞不是太少,沒有關(guān)系.之所以長的慢或有死細(xì)胞,大概是消化時(shí)EDTA的損傷造成的,細(xì)胞恢復(fù)活性需要一定時(shí)間,且一旦活性恢復(fù),細(xì)胞將長得很快.  

　　人肝癌BEL-7402細(xì)胞傳代步驟：

 1. 棄去舊培養(yǎng)液（可用巴氏吸管吸去，也可直接翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)面朝上，直接倒掉培養(yǎng)液）。

 2.PBS沖輕緩漂洗細(xì)胞兩遍，盡量洗去殘余血清，棄PBS液。

 3 加0.25%胰酶（以蓋滿瓶底為標(biāo)準(zhǔn)）于37度條件下消化，倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞解離程度以細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞近乎縮成圓形為準(zhǔn)。

 4.直接加含血清的1640培養(yǎng)基（或血清)終止消化。

 5.用彎頭吸管均勻有序的吹打細(xì)胞，動(dòng)作不宜過猛，防止起泡產(chǎn)生。

 6. 離心5分鐘（1000轉(zhuǎn)/分鐘），去上清。加入PBS液吹打混勻，再離心一遍。

 7. 用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1：3傳代！

 8.補(bǔ)加培養(yǎng)液至所用培養(yǎng)瓶容積的1/10為準(zhǔn)。

 9.送孵箱培養(yǎng)。

　　小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的消化及傳代，

 RAW264.7因是單核巨噬細(xì)胞其生物學(xué)特性就是貼壁特別牢。

　　我得操作如下：

　　實(shí)驗(yàn)前將DPBS及DMEM加溫到37度 使用Flask75培養(yǎng)瓶：

 1、細(xì)胞貼壁生長，長滿瓶底70％時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加DPBS10ml漂洗一至兩次；棄去

 2. 加入10mlDPBS,然后用scratcher輕輕刮即可，離心后去除DPBS.用DMEM培養(yǎng)液10ml復(fù)吹打混懸細(xì)胞  

 3.分入新的培養(yǎng)瓶；

 4. 入37℃5％CO2孵箱，幾小時(shí)后即可再貼壁。  

　　卵巢癌細(xì)胞SKOV3

　　貼壁生長，傳代步驟：

 1.倒掉舊培養(yǎng)液，盡量倒凈。

 2.如果是50ml的培養(yǎng)瓶，加入約1ml0.25％胰酶中和殘留培養(yǎng)液，倒出。也可用D-HANKS液洗一次，可以節(jié)約胰酶。

 3.再加1ml0.25％胰酶消化，本人體會(huì)，新開瓶（指分裝的小瓶）使用的胰酶消化能力強(qiáng)，可以減少用量至0.5－0.8ml,已用較久的胰酶如用少了就不管用。

 4.鏡下觀察，如果80％以上細(xì)胞都回縮變圓，立刻將培養(yǎng)瓶豎起，防止過度消化。

 5.倒掉胰酶，用含10％小牛血清1640培養(yǎng)液5ml加入瓶內(nèi)，按順序輕吹打，如瓶底由模糊變透亮，說明細(xì)胞已從瓶壁吹離。

 6.此種細(xì)胞生長較快，所以一般按1傳5－6傳代，按瓶數(shù)補(bǔ)足培養(yǎng)液，吹勻后分別接種到新瓶中。

 7.根據(jù)培養(yǎng)液顏色變化所提示的酸堿度變化，一般2天左右換液一次。 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304：在含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清（FPS）的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，3-4d換液傳代一次。實(shí)驗(yàn)時(shí)采用對數(shù)生長期細(xì)胞。傳代時(shí)先倒掉舊培養(yǎng)液，用pbs５ml洗兩遍，再加入0.25%的胰酶+0.01%edta，加入的量以能覆蓋瓶底為準(zhǔn)。加入后輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使液體覆蓋瓶底，然后大約半分鐘左右看一次，對著光源觀察瓶底細(xì)胞黏附面是否有裂縫（如有則在顯微鏡下可見細(xì)胞之間出現(xiàn)間隙且有大部分細(xì)胞呈現(xiàn)圓形），倒掉，加入含低濃度血清培養(yǎng)液，然后吹打瓶底各處使細(xì)胞脫落。離心后去除上清液，加全培，再分４瓶，補(bǔ)加培養(yǎng)液。這樣操作步驟可大大簡化，不需要將培養(yǎng)瓶拿出拿進(jìn)操作臺(tái)了．

　　附:消化緩沖液(0.25%)胰蛋白酶：胰蛋白酶干粉1.25g，0.1gEDTA，溶于50ml 10×D-Hanks溶液中，調(diào)節(jié)至PH 7.6，定容至500ml，22um濾膜過濾除菌，分裝后-20℃保存?zhèn)溆?/p>